环形RNA是mRNA在剪接的过程中,上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起,从而形成的首尾相接的环状RNA分子。 近来的研究表明,高等动物中环状RNA的种类和含量远远超过预期。最近的研究发现circularRNA可以作为“microRNA海绵”,竞争结合microRNA从而解除这些microRNA对其他靶标的调控;同时保守型分析发现环状RNA上潜在具有多种RNA结合蛋白的结合位点,暗示circular RNA可以调控RNA结合蛋白的功能。更为重要的是,circular RNA的表达呈现出很强的组织特异性,暗示这些circular RNA具有重要的生物学功能。但目前对circular RNA的研究刚刚起步,这类RNA的生物学功能还有待挖掘,因此是一个值得深入的研究方向。
环状RNA特点
样本要求
实验流程
检测原理
通过高通量测序技术检测circRNA最关键的原理是寻找反向剪接的reads,即back-splicing reads。
分析结果
1. circRNA预测及数目统计
应用Memczak等[1]的方法进行circRNA的预测。每个样本mapping到基因组各个染色体的reads以及back-splicing reads可以通过圈图展示。
图1. 基因组覆盖分布图。
以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布,图中最外圈为基因组,里面每一个圈表示一个样本的染色体reads覆盖,其中红色代表该样本中back-splicing reads的覆盖情况。
对所有预测获得的circRNA与circBase数据库[2]的已知circRNA的位置信息进行比较,可以区分出新预测出来的novel circRNA和已知的known circRNA,统计如下:
2. circRNA表达定量及差异分析
目前,对于绝大多数的circRNA而言都无法获得其完整的序列[3],因此只能用circRNA的back-splicing位点处的junction reads来计算其表达量,这里我们采用SRPBM [4]对reads进行归一化处理。用edgeR [5]软件计算筛选差异表达的circRNA,得出p-value后进行多重假设检验校正,通过控制FDR(False Discovery Rate)来决定p-value的阈值,校正后的p-value即q-value。
根据circRNA的位置信息,可以获得与circRNA所在基因组位置上相关联的蛋白编码基因,然后我们对差异circRNA所对应的基因进行GO和KEGG富集分析。
图3. circRNA关联基因的GO富集散点图
用miRanda软件[6]预测差异表达circRNA与miRNA的靶向结合关系,并绘制网络图。