DNA测序
1、测序原理
Sanger法即双脱氧链终止法（Chain Termination Method），是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后通过高分辨率变性凝胶电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
3730XL测序仪的特点:
应用范围：
¨ DNA测序：医学测序；细菌、真菌鉴定；杂合子、突变检测。
¨ SNP研究：SNaPshot Multiplex；SNPlex；定量PCR TaqMan探针杂交。
¨ 片段分析：基于STR的法医鉴定：HID；基于STR的基因连锁定位：LMS；突变筛查：SSCP；农牧业育种：AFLP。
¨ 基因定量：定量PCR探针法与染料法。
服务特色
（1）速度快：收到样品后，质粒和PCR产物16-20小时出结果，菌24-36小时出结果。
（2）数据准：测序单序列精准读长可达800～900bp，质量QV值稳定可靠。
（3）经验足：经验丰富的专业技术人员，标准的SOP实验流程和严格的质量控制，测序数据真实可靠。
（4）技术强：丰富的处理困难模板的经验，自主研发的试剂配比能有效解决如GC
rich、poly结构、重复结构、发夹结构、16sRNA样品模板、PET系列样品模板等难题。
4、送样注意事项
可提供菌液、质粒、PCR产物等样品进行测序，送样时请注意：
菌液模板
（1）请注明培养基、抗性、载体名称、测序引物。
（2）我们常备Amp，Kan，CHL三种抗生素，其他抗性请自备。特殊抗性或特殊培养条件的样品最好提供5ml新鲜菌液或沉菌。
（3）请提供不少于100μl的新鲜菌液，于离心管中封口保存，防止交叉污染或泄漏，我们会为您培养并免费抽提质粒。
（4）如果是病毒(包括噬菌体)DNA、低拷贝质粒以及BAC DNA请纯化好模板直接用于测序。请不要直接送噬菌体菌液。
质粒模板
（1）除噬菌体和低拷贝质粒以及BAC DNA外，我们不建议提供质粒进行测序。
（2）质粒要求浓度>100ng/μl，体积>10μl。如果每个样品需测多个反应，则送样时需相应提高样品的量。
（3）请将质粒溶解在ddH2O中(请勿溶解在TE溶液中)。
（4）若质粒较大，请注明载体长度；若质粒拷贝数低，请注明具体拷贝数。
PCR原液
（1）PCR产物需电泳检测条带清晰无杂带，片段大小在150bp-2000bp之间，且体积≥50μl，浓度≥50ng/μl。
（2）小于150bp和大于2Kb的DNA片段请克隆后再测序。
（3）请注明片段长度，便于Agarose凝胶电泳割胶纯化时回收目的条带。
（4）PCR测序引物需经过PAGE纯化，浓度≥5pmol/μl，总体积＞10μl；若提供干粉，请注明OD值。随机引物、标记引物和简并引物不适合用于测序。
PCR已纯化产物
（1）若提供已纯化的PCR产物，请务必进行Agarose凝胶电泳纯化，将回收的DNA溶解在灭菌的去离子水中（请不要溶解在TE中）。
（2）要求：浓度>50ng/μl，体积10μl以上。如果每个样品需测多个反应，请注明测序片段长度，送样时需相应提高样品的量。
（3）需自行提供PCR引物，准确标明引物浓度，浓度≥5pmol/μl，总体积＞10μl，引物要求PAGE纯化。
测序引物要求
（1）引物必须PAGE纯化。
（2）引物浓度≥5pmol/ul，总体积＞10μl，需注明准确浓度。
（3）引物长度大于25base及小于18base不适合测序。
（4）随机引物、标记引物和简并引物不适合测序。
（5）尽可能提供引物全序列、PCR退火温度等信息。若提供引物序列，请注明是否需要合成。
5、免费服务项目
根据不同的需求，我们还可以为合作伙伴免费提供：
（1）序列拼接
（2）测序引物设计与评估
（3）DNA序列的基本分析
（4）样品和引物的保存及返还（质粒、PCR产物和引物保存2-3个月，菌种保存1-2个月）
6、测序结果说明
（1）测序完成后，我们对每个订单提供完整的测序报告，其中包括：
测序彩色峰形图（可用Chromas、Sequencing Analysis 5.2软件打开）
序列文件（可用Word文档或记事本格式打开）
拼接序列（需要测通的样品）
（2）正常情况下，3730测序仪保证800bp的有效长度，但是有时由于DNA结构上的原因，会出现反应中断无法进行的情况，如：G/C rich；G/C Cluster；Poly A/T/C/G的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现的套峰现象，此种情况一般为DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有两个以上结合位点。
以上情况是由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况，我们会根据具体测序结果进行相应收费。出现以上情况后，我们提倡从另一端进行测序，或者用特殊试剂进行测序。
测序收费标准
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测序现象 |
可能原因 |
是否收费 |
备注 |
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收 |
不收 |
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反应失败 |
测序反应中实验操作和仪器等问题 |
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反应失败 |
客户提交模板质量问题（浓度低，降解等） |
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质粒抽提失败 |
质粒过大、扩增不好或转化不佳 |
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鉴定质粒或PCR产物浓度 |
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帮助客户设计引物或进行测序结果的拼接 |
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对于特殊结构模板 |
片段含有高级结构、高GC含量、含有重复序列polyA/T/G/C |
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测序图谱中出现套峰 |
非单克隆、杂合子、双位点结合、Poly结构、PCR非特异性扩增 |
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同一样品Walking测序，按照测通的反应数来计算 |
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引物合成单独收费 |
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客户提供的引物导致结果不理想 |
引物不纯、标记过的引物、引物含有发夹结构或自身存在末端二聚体 |
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客户提供的质粒导致结果不理想 |
模板不纯、浓度不够、容量不足，而客户强烈要求进行测序的 |
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PCR片段的切胶纯化 |
切胶纯化后测序结果正常 |
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收取切胶费用 |
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质粒抽提 |
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同一样品的验证性实验两次结果一致 |
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两次都收费 |
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（3）备注说明
一般正常的质粒和PCR产物自收样日至发送报告时间为16-20小时，菌24-36小时出结果。对于两个工作日内无法得到满意测序结果的，我们会用E-mail或电话与客户或代理商沟通解决。
并不是所有的样品都能得到满意的测序结果，对于测序结果不好的订单，我们会尽力找到可能的原因，并建议进一步如何操作。
