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1. 质粒转化
具体操作步骤:
l 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管;
l 将感受态细菌(competent cells)从-70℃冰柜中取出,快速吸取50ul感受态细菌,加入含质粒DNA的1.5ml的离心管;
l 轻轻地旋转以混匀内容物,在冰中放置30~60 min;
l 42度热休克90s(该时间应该非常准确,用Timer记时),冰上放置5min;
l 每管加500ul LB培养液,放37℃水浴1h;
l 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上,涂布棒将培养液涂布均匀;
l 倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。
2. 质粒的抽提
具体操作步骤:
l 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ(加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃);
l 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
l 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm),接种到10ml LB培养液37℃剧烈振摇培养16 h;
l 取4ml菌液到5ml 离心管,8000rpm室温离心3min;
l 去上清,放于面巾纸上吸干痕液,
l 加250 ul Solution Ⅰ(注意用前应该加RNase A管),于涡旋振荡器重悬细胞;
l 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ;
l 加350 ul Solution Ⅲ,将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次;
l 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中,
l 室温孵育2-3min,12000rpm 4℃离心15 min;
l 装配2ml 收集管(白色)和柱状收集管(蓝色)
l 将上清倒入柱状收集管(蓝色)中;
l 8000rpm室温离心3min;
l 去掉收集管中的液体,加500ul Buffer HB 到柱状收集管中,10000rpm室温离心1min;
l 去掉柱状收集管中的液体,加750ul Wash Buffer(注意用前加乙醇),10000rpm室温离心1min;
l 重复上述步骤一次;
l 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min;
l 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中,加65ul灭菌水,室温放置2min,8000rpm室温离心3min 洗提(洗脱)DNA。
3. 质粒电泳
具体操作步骤(以倒20ml的胶为例):
l 用50ml量筒量取20ml 1XTAE;
l 用电子天平称量0.16g琼脂糖,并倒入20ml电泳缓冲液中;
l 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中,放入微波炉中转1min30s,至肉眼看不到颗粒状琼脂为止;
l 至室温待溶液冷却至60度左右,将三角瓶中溶液倒入制胶盒中,并加入上样梳子;
l 至室温约30min胶凝固后,拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内;
l 向电泳槽加入电泳缓冲液,刚好没过凝胶约1mm;
l 将样品中加入适量的10X上样缓冲液,该上样缓冲液的体积计算如下:如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液,如果是30ul,加入3ul 10X上样缓冲液;
l 将样品加入上样槽中,打开电源,一般为120v,电泳约20-30min,关掉电源,在Dark Reader荧光透射仪观察结果。
4. 质粒回收
具体操作步骤:
l 先将水浴箱打开调温至50℃;
l 在电泳的作用下分离DNA片段;
l 戴防护眼镜用Dark Reader荧光透射仪切割需要的DNA条带,DNA条带暴露于荧光灯的时间<30 s;
l 加入700ul binding buffer;
l 于50-55℃水浴箱中孵育5 min,期间在涡旋振荡器上振荡2-3次,使凝胶完全溶化;
l 将溶化后的DNA/agarose 溶液加到柱状-收集EP管中8000rpm室温离心3min,倒掉液体;
l 加500ul Bind Buffer,8000rpm室温离心1min,倒掉液体;
l 加750ul Wash Buffer 液,10000rpm室温离心1min,倒掉液体;
l 加750ul Wash Buffer 液,8000rpm室温离心1min,倒掉液体;
l 去掉收集管中的液体,将空柱状EP管8000rpm室温再次离心1min,用电风扇吹1min,以防止柱状管基质中带有残余乙醇
l 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml EP管中,加35ul DNA Elution Buffer,室温放置3min,8000rpm室温离心3min 洗提(洗脱)DNA。
l 将回收DNA进行电泳观察片段浓度;
5. 连接反应
连接体系一般为:
(1) 载体:1ul
(2) 片段:12ul
(3) 10X 连接Buffer:2ul
(4) T4连接酶:1ul
(5) H2O:5ul
加入的顺序为:(5)-(3)-(1)-(2)-(4)
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