lncRNA与microRNA的靶点验证

lncRNA的作用机制有很多，以ceRNA（competing endogenous RNA，竞争性的内源RNA）形式发挥功能是其中的一种，即lncRNA与靶基因的3’UTR竞争结合相同的microRNA，降低microRNA对靶基因的抑制功能，从而上调靶基因的表达量。为了检测其效果，我们可以用Western Blot检测靶蛋白的表达水平，也可以用qRT-PCR检测靶基因的表达。但是这两种方式都无法确定lncRNA是否通过ceRNA方式调控靶基因的表达。因此，我们可以通过“microRNA与lncRNA结合验证”，“microRNA与靶基因结合验证”和“lncRNA与靶基因3’UTR竞争结合microRNA验证”实验，构建Sensor reporter并进行活性检测，对lncRNA，microRNA与靶基因这三者间的作用机制作出准确判断。

服务优势：

（1）利用专业软件进行miRNA与lncRNA和靶基因3’UTR区的结合位点预测；

（2）采用Promega公司特有psiCHECK质粒；

（3）所采用的Luciferase双荧光报告系统，可以获得宽泛的线性定量范围与极高的灵敏度；

（4）采用瞬时转染技术，操作简便、快速，周期短，适用于绝大多数细胞类型。

服务流程：

一、microRNA与lncRNA结合验证

（1）直接合成靶lncRNA序列或microRNA在靶lncRNA上的结合位点序列；

（2）将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒；

（3）购买microRNA mimics；

（4）将报告载体与microRNA mimics共转染293T细胞；

（5）多功能酶标仪检测报告基因的表达水平；

（6）数据分析，整理提交客户原始数据及项目报告；

 注：为了实验的严谨性，可加入靶lncRNA序列中microRNA预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

二、microRNA与靶基因结合验证

（1）直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的结合位点序列；

（2）将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒；

（3）购买microRNA mimics；

（4）将报告载体与microRNA mimics共转染293T细胞；

（5）多功能酶标仪检测报告基因的表达水平；

（6）数据分析，整理提交客户原始数据及项目报告；

 注：为了实验的严谨性，可加入靶基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

三、lncRNA与靶基因3’UTR竞争结合microRNA验证

（1）直接合成靶基因3’UTR序列或microRNA在靶基因3’UTR上的结合位点序列；

（2）将上述合成的DNA片段克隆至报告基因载体psiCHECK质粒；

（3）直接合成lncRNA序列，构建lncRNA过表达质粒；

（4）将报告载体与lncRNA表达载体共转染293T细胞；

（5）多功能酶标仪检测报告基因的表达水平；

（6）数据分析，整理提交客户原始数据及项目报告；

 注：为了实验的严谨性，可加入靶基因3’UTR区microRNA预测结合区域的突变型报告载体及lncRNA序列中microRNA预测结合区域的突变型表达载体作为对照，进一步说明问题。