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1. 质粒转化
具体操作步骤：
l 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；
l 将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；
l 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；
l 42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；
l 每管加500ul LB培养液，放37℃水浴1h；
l 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；
l 倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
2. 质粒的抽提
具体操作步骤：
l 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；
l 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
l 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10ml LB培养液37℃剧烈振摇培养16 h；
l 取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；
l 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，
l 加250 ul Solution Ⅰ（注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；
l 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；
l 加350 ul Solution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；
l 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，
l 室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；
l 装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）
l 将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；
l 8000rpm室温离心3min；
l 去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；
l 去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；
l 重复上述步骤一次；
l 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；
l 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。
3. 质粒电泳
具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：
l 用50ml量筒量取20ml 1XTAE；
l 用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；
l 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；
l 至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；
l 至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；
l 向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；
l 将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul 10X上样缓冲液；
l 将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。
4. 质粒回收
具体操作步骤：
l 先将水浴箱打开调温至50℃；
l 在电泳的作用下分离DNA片段；
l 戴防护眼镜用Dark Reader荧光透射仪切割需要的DNA条带，DNA条带暴露于荧光灯的时间<30 s；
l 加入700ul binding buffer；
l 于50-55℃水浴箱中孵育5 min，期间在涡旋振荡器上振荡2-3次，使凝胶完全溶化；
l 将溶化后的DNA/agarose 溶液加到柱状-收集EP管中8000rpm室温离心3min，倒掉液体；
l 加500ul Bind Buffer，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
l 加750ul Wash Buffer 液，10000rpm室温离心1min，倒掉液体；
l 加750ul Wash Buffer 液，8000rpm室温离心1min，倒掉液体；
l 去掉收集管中的液体，将空柱状EP管8000rpm室温再次离心1min，用电风扇吹1min，以防止柱状管基质中带有残余乙醇
l 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml EP管中，加35ul DNA Elution Buffer，室温放置3min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。
l 将回收DNA进行电泳观察片段浓度；
5. 连接反应
连接体系一般为：
（1） 载体：1ul
（2） 片段：12ul
（3） 10X 连接Buffer：2ul
（4） T4连接酶：1ul
（5） H2O：5ul
加入的顺序为：（5）-（3）-（1）-（2）-（4）
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