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慢病毒载体的包装与纯化

　　1实验流程

　　制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,感染Hela细胞后定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。

2实验材料

　　2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株

　　慢病毒载体系统该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件.

　　细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

　　菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

3慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱

　　该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的穿梭质粒。其中穿梭质粒（目的穿梭质粒）含有能表达绿色荧光蛋白（GFP）；pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件。

　　3.1穿梭质粒：目的穿梭质粒

　　3.2pRsv-REV

　　3.3pMDlg-pRRE

　　3.4pMD2G

4慢病毒生产实验步骤

　　4.1慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293 T细胞，细胞密度为0.5×10时；重新接种于25 mL的15cm细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养；

　　4.2制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；

　　pRsv-REV 10 μg，

　　pMDlg-pRRE 15 μg，

　　pMD2G 7.5 μg,

　　干扰质粒 20 ug

　　加入无菌水定容至1800 μL, 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min；

　　4.3 当细胞密度达60%～70%时转染. 将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.；

　　4.4每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h.；

　　4.5收集转染72 h的293T细胞上清液；

　　4.6将收集的上清液于4℃，4000 g离心10 min，收集上清液；

　　4.7将各种不同RNA干扰质粒上清液以0.45 μm滤器过滤；

　　4.8于40 mL超速离心管中，4℃，25000 r/min离心20 min；

4.9而后以冰PBS液，分别溶于500ul Dmem,和500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜 

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